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    熒光檢測知識普及原理

    發(fā)布時間: 2021-02-04  點擊次數: 2411次

    很多細胞實驗都要檢測熒光,為方便大家選擇合適的方法,在此簡單說一下各種熒光檢測方法的特點。不足的地方,歡迎大家補充:

    1、流式,優(yōu)點是速度快,非常適合做大數量統(tǒng)計,且樣品只被檢測一次,*不用擔心熒光淬滅的問題。缺點是只能檢測熒光的有無、強度大小,無法提供空間定位信息,無法做熒光定位變化的實驗;由于樣品只被檢測一次,因此無法對同一個樣品進行連續(xù)觀察。例如,做膜蛋白定位時會得到這么一個結果——用流式可以檢測出信號,但是用顯微鏡卻看不到東西,排除儀器和濾光片選擇問題,很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標記造成流式的假陽性結果。

    2、熒光顯微鏡,剛好與流式互補,可很好地進行空間觀察,判斷目標蛋白的定位,但是不適合做大流量檢測,估計沒人能經得起時間的考驗。有不同倍率的物鏡選擇,可以使用高倍物鏡看精細結構,或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計。與之搭配的CCD和軟件,是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關鍵。尤其是CCD,從那么多商品里選一款合適的不容易,需要了解很多知識否則只能聽別人忽悠。

    3、共聚焦,熒光顯微鏡的升級產品,具有很好的光學層切效果,能得到很好三維定位信息。但是,如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照,取得一張好看的圖片,就讓人覺得可惜了。共聚焦基本都是全自動系統(tǒng),可隨意定義照明區(qū)域、選擇多個熒光通路和設定定時取圖,所以,做Time-laps、FRAP和FRET有其獨到的優(yōu)勢。另外,4Pi和STED又是其中的極,具有超高的空間分辨率,只是使用不方便,未必適合做生物實驗。

    4、全內反射,熒光顯微鏡的另一種升級產品,屬于近場光學范疇,只適合且合做膜研究,無法看到胞內信息。也是用CCD成像,但是對CCD的要求更高——個人甚至覺得對CCD的要求是沒有上限的。

    5、雙光子,另一種共聚焦,因使用長波激發(fā)熒光,故能做深層檢測(突破共聚焦的100微米極限),典型的應用是觀察活體腦組織。巨貴無比,國內沒有幾臺,能用上的人不多——就不說了。

    6、新推出的高內涵藥篩系統(tǒng),流式和顯微鏡的雜合體,使用電動載物臺,可以自動地按預定程序完成實驗,可做大流量檢測(雖然速度慢點),而且有成像能力,可以判斷定位。前段時間,國內哪裝了一臺,很多人在吹,但我實在不知道其中的好處——任何一臺帶電動載物臺的顯微鏡都可以達到相似的效果,只要軟件支持——估計有人賺大發(fā)啦!

    從以上的簡介可以看出,只要是熒光樣品,就應該都可使用以上儀器檢測(只用TIRF受一些限制)。但是實際應用時,大家可能會碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡,但是無法使用共聚焦。為什么?解釋一下:

    首先,熒光檢測必須有激發(fā)光照明,染料被特定波長的光照射以后才能發(fā)射熒光。激發(fā)光源有兩種:1)白光(汞燈、氙燈等),然后通過濾光片選擇只通過特定波長的光。如檢測GFP時,大家能看到藍光照射在樣品上,因為GFP的激發(fā)條件是488nm 光。但是有一點,顯微鏡不可能裝無限多的濾光片,所以選擇是有限的。2)激光,普通的激光器只能發(fā)射特定波長的光,且數量有限,常見的是405、488、514、543、633等,所以可使用的染料也是有限。因此,大家判定儀器能否滿足你實驗要求,務必先看看激發(fā)條件是否合適。

    其次,在光檢測器(PMT、CCD)前還有一塊濾光片,作用是反射樣品各種散射光,只通過特定波長的熒光,提高信噪比,得到干凈的背景。因此,這塊濾光片也決定了儀器能否滿足你的實驗要求(不用太擔心,這個一般和激發(fā)濾光片配套,不會有太多問題)。而在光譜型共聚焦里,使用的是棱鏡或衍射光柵分光,可以選擇通過任意需要的波段。這對使用量子點做標記的同學特別有好處!

     

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